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发表于 2008-2-3 13:58:30
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3 生物质谱技术的应用/ y! f8 w& L4 U0 f' q
" m# M4 {/ r6 k- p# a! j. R" E6 N 随着质谱技术的不断改进和完善,质谱的应用范围已扩展到生命科学研究的许多领域,特别是质谱在蛋白质、医学检测、药物成分分析及核酸等领域的应用,不仅为生命科学研究提供了新方法,同时也促进了质谱技术的发展。: u& y1 k6 y A5 ~! `
2 d2 L$ i, o& O* [ 质谱与蛋白质分析. u( ~' B S4 ?4 x8 A5 u
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蛋白质分子量的测定 蛋白质类生物大分子分子量的测定有着十分重要的意义,如对均一蛋白质一级结构的测定,既要测定蛋白质的分子量,又要测定亚基和寡聚体的分子量及水解、酶解碎片的分子量。常规的分子量测定主要有渗透压法、光散射法、超速高心法、凝胶层析及聚丙烯酸胺凝胶电泳等。这些方法存在样品消耗量大,精确度低易受蛋白质的形状影响等缺点。9 M9 U: c# B8 M
& G& F. D$ D0 n( h/ w MALI-MS技术以其极高的灵敏度、精确度很快在生物医学领域得到了广泛的应用,特别是在蛋白质分析中的应用,至今已被分析的蛋白质已有数百种之多,不仅可测定各种亲水性、疏水性及糖蛋白等的分子量,还可直接用来测定蛋白质混合物的分子量,也能被用来测定经酶等降解后的混合物,以确定多肽的氨基酸序列。可以认为这是蛋白质分析领域的一项重大突破。- \6 y/ x; x8 y, k; i' y
1 K+ r0 l! i+ c, C+ c 蛋白质组研究 蛋白质组是指一个基因组、一个细胞或组织所表达的全部蛋白质成分。蛋白质组的研究是从整体水平上研究细胞或有机体内蛋白质的组成及其活动规律,包括细胞内所有蛋白质的分离、蛋白质表达模式的识别、蛋白质的鉴定、蛋白质翻译后修饰的分析及蛋白质组数据库的构建。质谱技术作为蛋白质组研究的三大支撑技术之一,除了用于多肽、蛋白质的质量测定外,还广泛地应用于肽指纹图谱测定以及氨基酸序列恻定等。6 a6 a* i) F2 c/ j% G
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肽指纹图谱( PePtide Mass Fingerprinting,PMF)测定是对蛋白酶解或降解后所得多肽混合物进行质谱分析的方法,对质谱分析所得肽片与多肽蛋白数据库中蛋白质的理论肽片进行比较,从而判别所测蛋白是已知还是未知。由于不同的蛋白质具有不同的氨基酸序列,因而不同蛋白质所得肽片具有指纹的特征。! l' [9 E- K4 ~1 ]
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采用肽指纹谱的方法已对酵母、大肠杆菌、人心肌等多种蛋白质组进行了研究。对大肠杆菌经PVDF膜转印的蛋白质的研究表明,三个肽片即可达到对蛋白质的正确识别。而采用原位酶解的方法对酵母蛋白质组研究的结果显示,约90%的蛋白质被识别,其中三十多种新蛋白质被发现,而这些蛋白质是酵母基因组研究中未能识别的开放阅读框架。研究显示,肽指纹谱的方法比氨基酸组成分析更为可靠,这是因为MALDI测定肽质量的准确度为99.9%,而氨基酸组成分析的准确度仅为90%。另外MALDI可以耐受少量杂质的存在,对于纯度不是很高的样品也能得到理想的结果。2 F v! N n2 Z' l7 i$ B5 D2 g
6 q+ c; U6 w0 J& S 对肽序列的测定往往要通过串联质谱技术才能达到分析目的,它采用不同的质谱技术选择具有特定质荷比的离子,并对其进行碰撞诱导解高,通过推断肽片的断裂,即可导出肽序列。5 M5 T9 @$ }% z5 i2 l
, V4 m7 L6 A4 i/ q' G m 质谱与核酸研究 5 @0 h0 I. E9 e4 _. @
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现代质谱技术自诞生以来在多肽及蛋白质的研究中获得了极大的成功,于是人们开始偿试着特质谱技术用于核酸的研究工作,近年来合成寡核苷酸及其类似物作为反义治疗剂在病毒感染和一些癌症的治疗方面有着良好的前景,寡核苷酸作为药物其结构特征必须进行确证。常规的色谱或电泳技术只能对其浓度和纯度进行分析,而对其碱基组成、序列等结构信息却无能为力。
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ESI和MALDI质谱技术的出现为寡核苷酸及其类似物的结构和序列分析提供了强有力的方法,它是将被测寡核苷酸样品先用外切酶从3’或5’端进行部分降解,在不同时间内分别取样进行质谱分析,获得寡核苷酸部分降解的分子离子峰信号,通过对相邻两个碎片分子质量进行比较,可以计算出被切割的核苷酸单体分子质量,将其与四个脱氧苷酸的标准分子量进行对照,就可以读出寡核苷酸的序列。由于MALDI技术分辨率的问题,使得其更适合于减基数较少的短链核酸的分析。) I4 l" }1 r% Y, b3 u
0 w, u' e( [; Y+ ^$ I' \ 如何获得高分辨率的DNA质谱图一时间成为了研究的热点问题,由于DNA的化学结构存在着不同于蛋白质的结构特征,使得DNA样品存在某些特殊性,一是其结构中存在着磷酸基团,有形成钠磷化合离子的趋势;二是在激光解吸离子化过程中它的结构不如蛋白质稳定,易形成碎片,这导致峰宽和分子离子的强度变弱,从而使得分辨率下降。
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1995年,M.L.Vestal等把离子延迟引出(lonDelayed Extraction, DE)技术应用于MALDI-MS中,不但提高了MALDI-MS的分辨率,而且也开创了质谱应用于DNA研究领域的新局面。国内邓慧敏等也应用DE-MALDI-MS法测定了混合碱基DNA,获得了高分辨率的DNA质谱图。7 u0 ~5 x4 y9 {4 n5 R W
8 E! u) n0 H5 I 质谱与临床医学
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( y% U1 Z. L N 除了应用于蛋白质和核酸研究以外,质谱还以其灵敏度和高分辨率在临床医学检直中得到了广泛的应用,如对药物代谢产物的动态分析,癌细胞蛋白质的鉴定,同位素标记物的检测等。其中用同位素14C标记的14C-尿素呼吸试验和15N标记的15N-排泄试验已成为临床检测胃幽门螺杆菌(HP)的有效手段。
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7 d0 k3 z9 |9 f 质谱与检测+ m5 I5 c/ Y8 N4 y9 ?8 \5 [8 u
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随着生物工程技术的发展,大量的生物工程产品不断出现,传统的测定分子量及纯度的方法已不能担当此重任,现在人们把MALDI-TOF-MS应用于此领域,得到了很好的效果。蔡耘等用上述技术对重组的人表皮生长因子(hEGF)白细胞介素-3(IL-3)、肿瘤坏死因子(TNF)粒细胞\巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G—CSF)碱性成纤维生长因子(bFGF)等六种基因工程产品进行了测定,获得了准确的分子量信息及纯度信息,这为基因工程产品的检测研究开辟了一条新途径。 |
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