冰片滴鼻对豚鼠鼻粘膜和血脑屏障通透性的研究

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1 a2 v; H5 ]3 E9 F; h" I! d摘要 目的: 观察不同浓度冰片滴鼻后对鼻粘膜和脑血管微循环通透性的影响。方法: SD大鼠随机分成五组，A组予0.5%冰片滴鼻，B组予1%冰片滴鼻，C组予2%冰片滴鼻，D组予组胺滴鼻，E组豚鼠予液体石蜡滴鼻，滴鼻后静脉注入伊文思蓝（EB），10min后处死动物取下鼻粘膜、脑组织，在紫外分光光度计上测定EB吸光度值和含量。结果: 0.5%冰片组 、1%冰片组、2% 冰片组滴鼻均可以促进伊文思蓝透过鼻粘膜和血脑屏障，在一定浓度内，伊文思蓝透过鼻粘膜和血脑屏障的量与冰片浓度成线性关系，其中2%冰片作用最明显。 结论:冰片滴鼻可以明显促进伊文思蓝透过鼻粘膜和血脑屏障 。

) e4 x) d& l' S! n关键词 冰片 鼻腔给药 鼻粘膜 血脑屏障 通透性

: v5 h' h) C' T* `0 ?鼻腔给药由来已久，近年来作用不断扩大，可用于全身疾病和中枢神经系统疾病的治疗。鼻粘膜下血管非常丰富，药物可直接通过鼻粘膜吸收进入体循环，还可以透过血脑屏障，避免口服给药的肝脏首过效应，且鼻粘膜用药方便，是一个较好的给药途径，受到越来越多的重视。冰片又称龙脑，是常用的开窍药和佐使药，具有“芳香走窜，引药上行”之功效。现在发现，冰片是一种较好的鼻粘膜促进剂，还能促进他药透过血脑屏障。鼻粘膜具有丰富的毛细血管，能对外界环境的变化，致炎物质及血管活性物质等产生灵敏的收缩或扩张反应。冰片除了自身的粘膜促进作用和透血脑屏障作用，是否对鼻粘膜和脑血管微循环也有作用？本实验拟对此进行研究。

1材料和方法
7 W6 n0 w3 X4 Y) U1.1 动物 健康豚鼠，雌雄各半，体重200±20g，由广东医学院实验动物中心提供，合格证号
( E. [. [* Z. d0 K1.2试剂 合成冰片(龙脑59．9％，异龙脑37．5％)，由广州化工厂提供；组胺，伊文思蓝(E．B．)，生理盐水配成2％溶液。
9 z) |% F) h6 W) }6 a' B& K2 }4 x5 z1.3仪器 752型紫外分光光度计，上海第三分析仪器厂；隔水恒温箱，；
1.4 实验方法
1.4.1 分组及给药 豚鼠50只随机分成A、B、C、D、E5组，每组10只，药后同一时间点采集样品。实验前夜禁食，不禁水。A组豚鼠予0.5%冰片滴鼻，B组豚鼠予1%冰片滴鼻，C组豚鼠予2% 冰片滴鼻(冰片均以液体石蜡为溶媒)，D组豚鼠予组胺（2µg/ml）滴鼻，E组豚鼠予液体石蜡滴鼻。用3%戊巴比妥腹腔注射麻醉后（0.1ml/100g体重），置于平板上仰卧固定。从股静脉注射2%伊文思蓝(0.5ml/100g体重)，各组分别迅速鼻腔滴入药物或液体石蜡100μl，，每侧50μl。于注射伊文思蓝10分钟后放血处死动物，用生理盐水经主动脉灌注，将血管中的伊文思蓝冲洗干净，打开鼻腔，取下鼻中隔粘膜及两鼻腔内整个鼻甲，开颅取出大脑（含两侧嗅球）。
1.4.2 伊文思蓝含量测定 将取出的组织用生理盐水轻轻冲洗，用滤纸吸干 ，精密称重，并置于含5ml二甲基甲酰胺的小瓶，37℃孵育24h，使兰染的标本退色。取兰染液3ml，置分光光度计620nm处比色，求出单位重量鼻粘膜、脑组织所含伊文思蓝的吸光度值（A值），并由标准曲线得出伊文思蓝的浓度。
1.5伊文思蓝—甲酰胺标准曲线 将伊文思蓝1mg溶于100ml的甲酰胺中．然后分别稀释成不同浓度(0.5、1.0、2.0、4.0、5.0×10-3mg／m1)，在紫外分光光度计上测定其吸光度，测定波长定为620nm，以浓度(C)为横坐标，以吸光度(A)为纵坐标，求得回归方程，
1.6 统计学处理 采用方差分析，所有数据均采用 x±s表示。
( b* |: g# X- A. G! P- E6 B- R
2 结果
2.1脑大体标本观察 液体石蜡组脑组织有轻微的蓝染现象，0.5%冰片组 、1%冰片组、2% 冰片组与液体石蜡组比较，脑组织有较明显蓝染现象，而且随着冰片浓度增加，脑组织蓝染程度逐渐加深，以2% 冰片组脑组织蓝染现象最明显，组胺组
2.2 鼻粘膜和脑组织EB含量比较 大鼠鼻腔给药十分钟后处死，取出鼻粘膜和大脑测定伊文思蓝的含量，结果见表。从表中可以看出，0.5%冰片组 、1%冰片组、2% 冰片组与液体石蜡组比较，鼻粘膜和大脑中伊文思蓝含量明显增加(p<0.05)，其中2%冰片作用最明显(p<0.01),2% 冰片组与组胺组比较，鼻粘膜和脑组织中伊文思蓝含量无明显差别(p>0.05)，说明2% 冰片组鼻腔给药可明显促进伊文思蓝透过鼻粘膜微循环和血脑屏障。
: y+ g% \+ A. O1 `2 C表 冰片和组胺滴鼻对鼻粘膜微循环通透性的影响
分组 动物数（n） 脑组织EB含量（&micro;g /g） 鼻粘膜EB含量（&micro;g/g）
液体石蜡组 10 6.2±0.4 10.4±3.2 0.5%冰片组 10 7.8±2.1* 16.2±4.1*1%冰片组 10 13.2±2.7** 20.8±4.4**2% 冰片组 10 18.3±3.4** 25.4±4.5**组胺组 10 19.5±3.7**# 26.7±4.9**#
# c6 t1 d5 d& ?9 f: u与液体石蜡组比较，* P<0.05 , **P<0.01。
  s% O: i$ y8 D/ |! V3讨论
冰片分子量为154.24,为小分子脂溶性单萜类物质,《本草纲目》记载:冰片具“通诸窍、散郁火”之功，具有开窍醒脑、清热止痛之功效。传统中医药理论认为，冰片“独行则势弱，佐使则有功”[1],目前在临床上的应用极为广泛。冰片是芳香开窍药的一种，研究表明冰片自身可以透过血脑屏障，还可以促进某些亲水性物质（伊文思蓝、泛影葡胺、庆大霉素、顺铂等）透过血脑屏障[1][2][3][4]。小白鼠口服3Ｈ-冰片5ｍｉｎ之后即可透过血脑屏障。冰片鼻腔给药同样可以促使某些药物透过血脑屏障,提高川芎嗪等药的生物利用度。孙寒静等[5]以气相色谱法测定鼻腔给药芎冰喷雾剂和川芎喷雾剂及灌服给药芎冰灌胃剂后一系列时间点采集血样作药动学分析，结果表明冰片使川芎秦迅速进入脑组织，并使其在脑内的时间稍延长，提高了在脑内的生物利用度。
鼻粘膜可吸收分之量在1000以下的药物分子，冰片经鼻腔给药后从鼻腔吸收，可从嗅神经通路或和嗅粘膜两条通路进入嗅球和CSF，发挥作用[6]。冰片促血脑屏障开放的机制未十分明了，赵保胜等[7][8]深入研究了冰片促药物透血脑屏障作用的特点,结果发现冰片有促使生理及病理情况下脑微血管内皮细胞生成ＮＯ的作用,说明其促血脑屏障开放与ＥＣ产生ＮＯ量增多有一定的关系。冰片诱导的ＢＢＢ开放与脑炎、脑外伤的病理性开放有着质的区别,其开放为生理性开放,冰片对脑及ＢＢＢ有一定的保护作用,其促血脑屏障开放不会引起脑的病理性损害。陈艳明等[9]认为冰片开放BBB与P-糖蛋白有关。
3 p. e. K6 ~0 t本实验证实，冰片鼻腔给药可以明显促进伊文思蓝透过鼻粘膜和血脑屏障。在一定浓度内，伊文思蓝透过鼻粘膜和血脑屏障的量与冰片浓度成线性关系，其中以2% 冰片最高。