PCR技术体外扩增DNA片段

浪漫小床 · 发表于 2008-1-30 09:18:26

一、目的
了解多聚合酶链反应DNA 扩增技术的基本原理和实验应用，掌握PCR反应基本技术。
二、原理
PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应是1986 年由Kallis Mullis 发现。这项技术已广泛地应用于分子生物学各个领域，它不仅可用于基因分离克隆和核酸序列分析，还可用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病诊断，肿瘤机制探查，法医鉴定等方面。PCR技术已成为方法学上的一次革命，它必将大大推动分子生物学各学科的研究发展。
PCR是一种利用两种与相反链杂交并附着于靶DNA两侧的寡核苷酸引物经酶促合成特异的DNA 片段的体外方法，由高温变性，低温退火和适温延伸等几步反应组成一个循环，然后反复进行，使目的的DNA 得以迅速扩增，主要过程如图6。置待扩增DNA 于高温下解链成为单链DNA 模板；人工合成的两个寡核苷酸引物在低温条件下分别与目的片段两侧的两条链互补结合；DNA聚合酶在72℃将单核苷酸从引物3'端开始掺入，沿模板5'—3'方向延伸，合成DNA 新链。由于每一循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，所以PCR 产物以指数方式增加，经25—30次周期之后，理论上可增加109倍，实际上可增加107倍。
PCR 技术具有操作简便、省时、灵敏度高特异性强和对原始材料质量要求低等优点，但由于所用的TaqDNA 聚合酶缺乏5'—3'核酶外切酶活性，不能纠正反应中发生的错误核苷酸掺入，估计每9000个核苷酸会导致一个掺入错误，不过Innis M·A 发现，错误掺入的碱基有终止链延伸的作用倾向，使得错误不会扩大。

图3－4 PCR 原理示意图
PCR 技术应用广泛，不可能有这样一套条件满足所有的实验，但本实验所介绍的方法可适应于大多数DNA 扩增反应，即使有的不适应，至少也确定了一个共同的起点，在此基础上可以作多种变化。不过下列因素在实验应用时应予以特别注意，以求取得满意结果。
1、模板：单、双链DNA 和RNA都可以作为PCR样品，若起始材料是RNA，须先通过逆转录得取第一条cDNA。虽然PCR 可以仅用极微量的样品，但为了保证反应的特异性，一般宜用ng 量级的克隆DNA，ug 级的染色体DNA，待扩增样品质量要求较低，但不能混合有任何蛋白酶、核酸酶，Taq DNA聚合酶的抑制剂以及能结合DNA 的蛋白质。
2、引物：引物是决定PCR 结果的关键，下列原则有助于引物的合理设计。（1）尽可能选择碱基随机分布，GC 含量类似于被扩增片段的引物，尽量避免具有多聚嘌呤、多聚嘧啶或其它异常序列的引物。（2 ）避免具有明显二级结构（尤其是在引物3'—末端）的序列。
（3 ）防止引物间的互补，特别要注意避免具有3'末端重叠的序列。
（4）引物的长度约为20个碱
基，较长引物较好，但成本增加，短引物则特异性降低。
（5）引物浓度不宜偏高，过高易形

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浪漫小床 · 发表于 2008-1-30 09:19:12

琼脂糖凝胶电泳检测DNA

实验目的  通过本实验学习用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。
实验原理
琼脂糖凝胶电泳分离DNA的能力是通过电荷效应和分子筛效应来完成的。DNA分子在高于等电点的PH溶液中带负电荷，在电场中从负极向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速率取决于DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速率与相对分子量的对数值成反比关系。在相对分子量相同的情况下，DNA分子的迁移速率依次为：超螺旋状DNA > 带切口环状DNA > 线形DNA。凝胶中琼脂糖的百分含量由被分离的DNA大小决定（参照下表）。电泳后的凝胶经溴化乙锭荧光染料染色，根据与DNA相对分子量标准物的比较，即可确定DNA片段的大小。
琼脂糖凝胶浓度%             线性DNA的有效分离范围Kb
0.3                               5-60
0.6                               1-20
0.7                               0.8-10
0.9                               0.5-7
1.2                               0.4-6
1.5                               0.2-4
2.0                               0.1-3
仪器琼脂糖凝胶电泳系统，紫外透射箱或凝聚图像分析仪
试剂
1. 0.5 ×TBE电泳缓冲液
2. 6 ×上样缓冲液
3. 琼脂糖
4. DNA相对分子量标准物（DNA  Marker）
1. 溴化乙锭（EB）
用水配制成10 mg/ml的溶液，使用浓度为0.5 g/ml。注意：溴化乙锭是一种强诱变剂并有中度毒性。使用含此染料的溶液时必须带手套。使用后的溶液和物品应专门处理，不要随意丢弃。
实验步骤
（一）制备1%的琼脂糖凝胶
称取1g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入100 ml的0.5 × TBE缓冲液，在微波炉中加热。完全融化后，冷却到60℃左右，加入5-10 l 的10 mg/ml溴化乙锭溶液后摇匀。
（二）胶板的制备
1. 用隔板将胶板的两端边缘封闭好。
2. 将胶板放在水平处，放好样品梳子(注意梳子底部距离胶板1-2 mm )。
3. 将冷却到60℃左右的琼脂糖凝胶缓慢倒入胶板中，注意不要产生气泡。胶厚度在8 mm之间。
4. 待胶凝固后，取出梳子，取下隔板，放入电泳槽内（注意：梳子的方向靠近负极）。
5. 向电泳槽中加入0.5 × TBE缓冲液，缓冲液要浸没凝胶。
（三）加样
1. 在样品中加入适量的6 ×上样缓冲液，使缓冲液的终浓度为1×。
2. 用微量移液器将已加入缓冲液的样品加入上样孔中。记录加样的顺序和加样量。（注意：加样的过程中不要让样品溢出上样孔）
（四）电泳
1. 接通电泳槽与电泳仪的电源（注意DNA片段是从负极向正极移动）。DNA的迁移速度与电压成正比。最高电压不超过5 V/cm。
2. 当溴酚蓝染料移动到凝胶的1/2 — 2/3 处时，停止电泳。
（五）观察实验结果
在紫外灯（360 nm或254 nm）下观察染色后的凝胶，DNA处显出橘红色的荧光条带。

浪漫小床 · 发表于 2008-1-30 09:19:41

实验三 DNA 片段的凝胶回收
实验目的  从琼脂糖凝胶中回收目的DNA条带。
目的DNA片段的回收技术是重组DNA中的关键技术，回收是指从电泳介质中纯化出目的片段。目前待回收的片段主要有酶切片段和各种PCR片段。回收的介质主要有琼脂糖和PAGE；回收的方法主要有树脂回收、离心柱回收、玻璃奶回收和透析袋大量回收等，下面介绍离心柱回收技术。
实验原理
采用可以高效、专一结合DNA的硅基质材料和独特的缓冲液系统，从TAE或TBE琼脂糖凝胶上回收DNA片段，同时除去蛋白质、其它有机化合物、无机盐离子及寡核苷酸引物等杂质。可回收100 bp－10 kb大小的片段。
本方法具有操作简单的特点，特别适合于PCR片段、酶切片段等的回收。
仪器：琼脂糖凝胶电泳系统，紫外透射箱，电子天平，高速冷冻离心机
试剂：
1. 0.5 ×TBE电泳缓冲液
2. 6 ×上样缓冲液
3. 琼脂糖
4. DNA相对分子量标准物（DNA  Marker）
5. 溴化乙锭（EB）
6.无水乙醇
7.离心柱型普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒
注意事项：
1. 电泳时最好使用新的电泳缓冲液，以免影响电泳和回收效果。
2. 如下一步实验要求较高，则应尽量使用TAE电泳缓冲液。
3. 切胶时，紫外照射时间应尽量短，以免对DNA造成损伤。
4. 如果回收率较低，可在胶充分溶解后检测pH值，如pH值大于7.5,
可向含有DNA的胶溶液中加10—30 µl 3 M醋酸钠（pH 5.2）将pH值调到5－7之间。
5.  回收<100bp 及>10kb的DNA片段时，应加大溶胶液的体积，延长吸附和洗脱的时间。
实验步骤
1. 紫外灯下将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量。
2. 向胶块中加入3倍体积溶胶液PN（如果凝胶重为0.1 g，其体积可视为100 µl，则加入300 µl溶胶液），50℃水浴放置10分钟，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可再补加一些溶胶液或继续放置几分钟，直至胶块完全溶解 (若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块)。
(胶块完全溶解后最好将胶溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在较高温度时结合DNA的能力较弱)。
3. 将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB1或CB2中（依所购买的试剂盒种类而定）（吸附柱放入收集管中），13,000 rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。
4. 向吸附柱中加入700 μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇）， 13,000 rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。
5. 向吸附柱中加入500 μl漂洗液PW， 13,000 rpm离心30秒，倒掉废液。
将离心吸附柱CB1或CB2放回收集管中，13,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温或50℃温箱数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。
如果漂洗液有残留会影响回收效率和DNA质量。
6．将吸附柱放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量65－70℃水浴预热的洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟。13,000rpm离心1分钟收集DNA溶液。
7．为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，重复步骤6。
CB1柱的洗脱体积不应少于20 μl，CB2柱的洗脱体积不应小于30 μl过小影响回收效率。
洗脱液的pH对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。
也可用TE buffer (10 mM Tris•Cl, 1 mM EDTA, pH 8.0)作为洗脱缓冲液，但EDTA会影响后续的酶反应等实验。

浪漫小床 · 发表于 2008-1-30 09:20:10

实验四 DNA的重组技术
实验目的  通过本实验学习DNA重组的原理和技术。
实验原理
DNA重组，即外源DNA分子与载体分子的连接，实际上是指在双链DNA的5'磷酸和相邻的3'羟基之间形成新的共价键。进行DNA连接的方法有很多，主要有粘端连接法和平端连接法。后者还包括平接法和接头法，以及平-粘连接法。选择这些方法的依据主要是外源DNA片段和质粒载体的末端以及它们限制性内切酶酶切位点的性质（参见下表）。
外源DNA
片段末端克隆的要求说明
平端高浓度的DNA和连接酶 1. 非重组体克隆的背景可能很高
2. 载体和外源DNA接合处的限制性酶切位点消失
3.  重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝
不同的突出端用两种限制酶消化后，需纯化 1. 载体和外源DNA接合处的限制性酶切位点可保留质粒载体以尽量提高连接效率
2. 非重组体克隆的背景较低
3.  外源DNA以一个方向插到重组质粒中
相同的突出端线形质粒DNA常用磷酸酶处理 1. 载体和外源DNA接合处的限制性酶切位点可保留
2. 外源DNA以两个方向插入
3.  重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝
DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。这两种DNA连接酶都具有将相同粘性末端的DNA分子连接在一起的功能。而T4噬菌体DNA连接酶还具有将两个平头末端的双链DNA分子连接在一起的活性，但后者的连接效率往往低于前者的连接效率。
T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为三步：首先，T4噬菌体DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶-AMP复合物；然后，酶—AMP复合物再结合到具有5'磷酸基和3'羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后，产生一个新的磷酸二酯键，封住切口。
许多耐热DNA聚合酶，如Taq DNA聚合酶，Taq DNA聚合酶等扩增的PCR产物在3'-末端后都带有一个突出的碱基A，而T 载体的3'-末端后都带有一个突出的碱基T，因此，T 载体是适用于克隆带有3'-末端A突出的PCR产物的克隆载体。而且T 载体具有β半乳糖苷酶阅读框，可通过蓝白斑筛选阳性克隆。
仪器  恒温水浴
试剂: pGM-T 克隆试剂盒：20次×2
pGM-T 载体(50 ng/µl) 20 µl
T4 DNA Ligase (3 U/µl) 20 µl
10×Ligation Buffer I 50 µl
2×Ligation Buffer II 100 µl
对照插入片段（700 bp, 50 ng/μl） 10 µl
无菌去离子水 1 ml
TOP10感受态(100 µl/管) 10 管
pUC19（0.1 ng/μl） 10 μl

实验步骤: （以下操作在无菌环境下进行）
1将载体在冰上融化（尽可能避免反复冻融载体，在初次使用时最好分装成小份，每次使用时取出一份），短暂离心装有载体的离心管，以免液体挂在管壁上。
2按照下表的内容在无菌的离心管中加入各种成分，载体与片段的摩尔比控制在1：3 — 1：8，请根据凝胶电泳或紫外分光光度计检测后的浓度及载体与片段分子大小来计算其摩尔比。加入过多的片段反而会干扰连接反应。
注：每个连接体系只从10×Ligation Buffer I或 2×Ligation Buffer II中任选一种，请不要同时加到一个管中。
连接体系中的成分反应体系阳性对照
目的PCR 片段 X μl --
对照插入片段（700 bp, 50 ng/μl） ¬¬¬-- 1μl
pGM-T Easy 载体 1 μl 1 μl
Ligase 1 μl 1 μl
10×Ligation Buffer I
（或 2×Ligation Buffer II 1 μl
5μl 1 μl
  5 μl）
无菌去离子水补足到10 μl 补足到10 μl
3 轻轻弹动离心管以混合内容物，短暂离心。使用10×Ligation Buffer I 的连接体系置于16℃过夜；使用2×Ligation Buffer II的连接反应体系置于25℃水浴反应10 分钟后，将离心管置于冰上。（建议最好使用10×Ligation Buffer I 的连接体系并置于16℃过夜，以达到更满意的连接效果）

浪漫小床 · 发表于 2008-1-30 09:20:32

实验五转化及重组子的筛选
实验目的  通过本实验学习转化及通过蓝白斑筛选重组子的原理和技术。
实验原理
转化是指将质粒DNA或构建的重组子导入细胞的过程。细菌细胞在低温，低渗（CaCl2溶液）中膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成了抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面。经42℃短时间热激处理后，促进了细胞吸收DNA复合物。重组质粒转化宿主细胞后，还需要对转化菌落进行筛选鉴定。通过α互补进行筛选是最常用的鉴定方法之一。
目前实验使用的许多载体都具有一段大肠杆菌β半乳糖苷酶的启动子及其编码α肽链的DNA序列，此结构称为laz' 基因。laz' 基因编码的α肽链与失去正常氨基末端的β半乳糖苷酶突变体互补，产生具有功能活性的β半乳糖苷酶分子，这种现象称为α互补。在IPTG（异丙基硫代β-D-半乳糖苷）的诱导下，β半乳糖苷酶能将X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）切割成半乳糖和蓝色的底物5-溴-4-靛蓝。因此，任何携带laz' 基因的质粒载体转化到β半乳糖苷酶突变的大肠杆菌细胞后，都会在涂有IPTG和X-Gal的培养基平板上形成蓝色菌落。当有外源DNA片段插入到位于laz' 中的多克隆位点后，就破坏了α肽链的阅读框，从而无法形成α互补，不能产生具有功能活性的β半乳糖苷酶，因此含有外源DNA片段的重组子的克隆在涂有IPTG和X-Gal的培养基平板上是白色菌落。
仪器超净工作台，恒温摇床，恒温培养箱，恒温水浴器
试剂
1.  氨苄青霉素（Amp）用无菌水配制成100 mg/mL的溶液，分装，不用高压灭菌，-20℃保存。
2.  50 mg/ml的IPTG 取0.5 g IPTG溶于8 mL双蒸水中，待完全溶解后补至10mL，用0.22µm滤膜过滤除菌，分装成小份，-20℃保存。
3. 将X-Gal溶于二甲基甲酰胺，配成20 mg/mL，不需过滤除菌，分装后避光保存于-20℃。
4.LB液体和固体培养基
LB培养基                                  1000 mL
细菌培养用的酵母抽提物（yeast extract）       5 g
细菌培养用的胰蛋白胨（Bacto—peptone）       10 g
NaCl                                        10 g
LB固体培养基: 取液体培养基500 mL, 加入琼脂粉 7.5g
高压灭菌后使用。
实验步骤
（一）制备含Amp的蓝白斑筛选琼脂平板（以下操作在无菌环境下进行）
1. LB固体培养基融化后，待冷却到60℃ 左右，加入氨苄青霉素（工作浓度为100 µg/mL），混匀，倒入培养皿中。
2. 培养基凝固后，在琼脂平板上加入40µL的20 mg/mL的X-Gal和4µL的200 mg/mLIPTG溶液，用涂布器（可用乙醇来清洗）涂匀。避光保存3h，以利于IPTG和X-Gal 的吸收。
（二）重组子的转化（以下操作在无菌环境下进行）
1、转化
（1）感受态细胞的选择
TOP 10，TOP10F´，DH5α，DH5α-T1 感受态细胞均可用于质粒的转化。
（2）转化平板的制备
向铺好的固体琼脂平板表面加入16 µl 50 mg/ml IPTG，40 µl 20 mg/ml X-gal，使用无菌的弯头玻璃棒将其均匀的涂开，避光置于37℃ 放置1－3小时，使溶解X－gal 的二甲基甲酰胺尽量挥发干净。
（3）转化
a. 取部分连接产物加到 50－100 µl 感受态细胞中（感受态细胞应刚从-70℃冰箱取出放于冰浴上，待刚刚解冻时加入连接产物，连接产物的加入量不超过感受态细胞体积的十分之一），轻弹混匀，冰浴30 分钟。（必要时请使用超螺旋质粒同时的转化感受态细胞作为对照检测转化效率）
b. 将离心管置于42℃水浴 60－90 秒，取出管后立即置于冰浴中放置2－3分钟，其间不要摇动离心管。
c. 向离心管中加入250－500 µl 37℃预热的SOC或LB ( 不含抗生素 ) 培养基，180 转，37℃ 振荡培养45分钟。目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。
d 将离心管内容物混匀，吸取100 μl已转化的感受态细胞加到含相应抗生素的SOB或LB固体琼脂培养基上，用无菌的弯头玻棒轻轻的将细胞均匀涂开。将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37℃培养12—16小时。
涂布用量可根据具体实验来调整。如转化的DNA总量较多，可取更少量转化产物涂布平板；反之，如转化的DNA总量较少，可取200—300 μl转化产物涂布平板。如果预计的克隆较少，可通过离心（4,000 rpm, 2分钟）后吸除部分培养液，留下适量的培养基悬浮菌体后将其涂布于一个平板中（涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的转化菌落数过少可以将剩下的菌液再涂布新的培养板）。
阳性对照的操作流程：
1. 取200 µL甘油保存的感受态细胞，低温融化后，加入1µL的空白质粒（DNA > 50ng），混匀，冰上放置30 min。
2. 将转化的混合物立即放入42℃ 循环水浴中90sec（注意：不要晃动）
3. 然后冰浴2 min。
4．将200ul的菌液直接涂于阳性对照的平板上
结果与讨论：平板培养过夜后应有蓝色和白色的菌落生长, 蓝色菌落较小, 在挑取后进行鉴定没有目的片段被扩增.

浪漫小床 · 发表于 2008-1-30 09:20:54

实验六质粒DNA的提取
【实验目的】通过本实验学习和掌握质粒DNA的提取方法。
【实验原理】碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线形染色体DNA在拓扑学上的差异进行分离的。在PH值为12.0-12.5时，线形染色体DNA的双螺旋结构被解开、变性，但共价闭合环状质粒DNA的两条互补链仍紧密的结合在一起。当加入pH 4.8的乙酸钾使PH值恢复为中性时，共价闭合环状质粒DNA能迅速而准确的复性，而线形染色体DNA由于两条互补链已分开，而不能迅速而准确的复性，而是相互缠绕形成网状结构。因此，通过离心，线形的染色体DNA，不稳定的大分子RNA，以及由SDS变性的蛋白质都一起沉淀下来，被除去。
【仪器】恒温摇床，低温离心机，高压灭菌锅，琼脂糖凝胶电泳系统，紫外透射箱
【材料】含有质粒的大肠杆菌菌液
试剂盒提取质粒
试剂:
1. 0.5 ×TBE电泳缓冲液
2. 6 ×上样缓冲液
3. 琼脂糖
4. DNA相对分子量标准物（DNA Marker）
5. 溴化乙锭（EB）
6.无水乙醇
7.离心柱型质粒小提试剂盒： 20次×2
溶液P1 7 ml
RNaseA（10 mg/ml） 70 μl
溶液P2 7 ml
溶液P3 10 ml
漂洗液PW 15 ml
洗脱缓冲液EB 15 ml
吸附柱CB3 20个
收集管（2 ml） 20个
【实验步骤】
试剂盒提取质粒方法
1．取1－5 ml过夜培养的菌液加入离心管中，13,000 rpm (~17,900×g) 离心1分钟，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。
2．向留有菌体沉淀的离心管中加入250 μl溶液P1 （请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。
3．向离心管中加入250 μl溶液P2，温和地上下翻转6－8次使菌体充分裂解。
温和地混合，不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5分钟，以免质粒受到破坏。
4．向离心管中加入350 μl溶液P3，立即温和地上下翻转6－8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。 13,000 rpm (~17,900×g) 离心10分钟，用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中，注意尽量不要吸出沉淀。
P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。
5．将上一步所得上清液加入吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），室温放置1－2分钟，13,000 rpm (~17,900×g) 离心30－60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
6．向吸附柱CB3中加入700 μl漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），13,000 rpm (~17,900×g) 离心30－60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
7．向吸附柱CB3中加入500 μl漂洗液PW，13,000 rpm (~17,900×g) 离心30－60秒，弃掉收集管中的废液。。
8．将吸附柱CB3重新放回收集管中置于13,000 rpm (~17,900×g) 离心2分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。将吸附柱CB3置于室温或50℃温箱放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。
9．将吸附柱CB3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50－100 μl经65-70℃水浴预热的洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟， 13,000 rpm (~17,900×g) 离心1分钟将质粒溶液收集到离心管中。
10. 为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，重复步骤9。
11. 用琼脂糖凝胶电泳检测质粒提取的结果。
对于大小超过10 kb的质粒在吸附和洗脱时可以适当的延长时间，以增加提取效率。
洗脱缓冲液体积不应少于50 μl，体积过小影响回收效率。
洗脱液的pH对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。
也可用TE buffer (10 mM Tris•Cl, 1 mM EDTA, pH 8.0)作为洗脱缓冲液，但EDTA可能会影响后续的测序反应等实验。
低拷贝或大质粒（>10kb）提取
如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒，应加大菌体使用量，使用5－10 ml过夜培养物，同时按比例增加P1、P2、P3的用量，洗脱缓冲液应在 70℃预热，其它步骤相同。
质粒DNA浓度及纯度检测
得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。电泳可能为单一条带，也可能为2到3条DNA条带，这主要与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。OD260值为1相当于大约50 μg/ml 双链DNA。
OD260/OD280比值应为1.7-1.9，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，但并不表示纯度低。因为pH值和离子存在会影响光吸收值。

bishengfan · 发表于 2008-3-8 13:58:23

好有价值的文章，正是我所需要的

nidaye · 发表于 2008-5-28 17:40:32

hehehhehehe

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PCR技术体外扩增DNA片段

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