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发表于 2008-1-30 09:20:54
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实验六 质粒DNA的提取. P% h2 g* A9 A2 T& V2 t
【实验目的】 通过本实验学习和掌握质粒DNA的提取方法。
0 D# r: _4 [; ~% W' ?" a【实验原理】 碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线形染色体DNA在拓扑学上的差异进行分离的。在PH值为12.0-12.5时,线形染色体DNA的双螺旋结构被解开、变性,但共价闭合环状质粒DNA的两条互补链仍紧密的结合在一起。当加入pH 4.8的乙酸钾使PH值恢复为中性时,共价闭合环状质粒DNA能迅速而准确的复性,而线形染色体DNA由于两条互补链已分开,而不能迅速而准确的复性,而是相互缠绕形成网状结构。因此,通过离心,线形的染色体DNA,不稳定的大分子RNA,以及由SDS变性的蛋白质都一起沉淀下来,被除去。3 S. G+ }! a& e) v! y$ A
【仪器】 恒温摇床,低温离心机,高压灭菌锅,琼脂糖凝胶电泳系统,紫外透射箱* S6 S i/ Q/ V- r
【材料】 含有质粒的大肠杆菌菌液# R" V N6 m. P! X# d, q) }) m
试剂盒提取质粒1 C; m. d8 v( N' Z {, f
试剂:
+ g" d' N( U0 g) A1. 0.5 ×TBE电泳缓冲液
$ n: X9 c) u( [, E6 M2. 6 ×上样缓冲液4 D: g5 ]2 E) q/ v- c1 ]3 u
3. 琼脂糖( Q# ~( z+ _! B& A! g) H# L% k
4. DNA相对分子量标准物(DNA Marker)
! m. V7 u l1 Q7 L9 _0 f5. 溴化乙锭(EB)$ l% c4 {$ U& Z) z: Q, h9 w( f- z7 {
6.无水乙醇
1 I* G. \, r" @$ W8 s; [- \9 [7.离心柱型 质粒小提试剂盒: 20次×2
! o0 }& X8 T% Y! _! Z( {8 v溶液P1 7 ml
`& k& h# P3 m6 A' A1 O6 G# JRNaseA(10 mg/ml) 70 μl
. Q A: A/ ]9 z" q' `5 p2 c溶液P2 7 ml
% H# D4 s5 j+ i溶液P3 10 ml
+ y' F2 M9 l0 I: }漂洗液PW 15 ml
' R0 f2 b+ N* Z& W洗脱缓冲液EB 15 ml
{+ X% `: \8 x3 `# M吸附柱CB3 20个
7 Q# }( e3 n" O0 a& H" M" t收集管(2 ml) 20个
% Q, { j5 c' N) O: O" H2 ?1 {4 m【实验步骤】& L: B3 Z4 Y/ }
试剂盒提取质粒方法* P1 ?6 H" ?& X3 ?/ m3 Y
1. 取1-5 ml过夜培养的菌液加入离心管中,13,000 rpm (~17,900×g) 离心1分钟,尽量吸除上清(菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。
; Q) X0 n+ \& I, G$ y2. 向留有菌体沉淀的离心管中加入250 μl溶液P1 (请先检查是否已加入RNaseA),使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
$ Z* d- b7 m6 c7 L如果有未彻底混匀的菌块,会影响裂解,导致提取量和纯度偏低。# u" ]% @ u5 D) P" a$ r+ G4 Y
3. 向离心管中加入250 μl溶液P2,温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。8 s* i4 R8 z |% i+ r- l
温和地混合,不要剧烈震荡,以免污染基因组DNA。此时菌液应变得清亮粘稠,所用时间不应超过5分钟 ,以免质粒受到破坏。: M( I1 A& h5 M
4. 向离心管中加入350 μl溶液P3,立即温和地上下翻转6-8次,充分混匀,此时会出现白色絮状沉淀。 13,000 rpm (~17,900×g) 离心10分钟,用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中, 注意尽量不要吸出沉淀。2 c: Q$ }4 O3 S4 l' c; F* q
P3加入后应立即混合,避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀,可再次离心后取上清。
# Q" ]! Z/ f7 f# T+ `+ j8 Z7 d/ i5. 将上一步所得上清液加入吸附柱CB3中 (吸附柱放入收集管中),室温放置1-2分钟,13,000 rpm (~17,900×g) 离心30-60秒,倒掉收集管中的废液, 将吸附柱重新放回收集管中。
( ^7 M# {! m3 d. a# p" j$ j6. 向吸附柱CB3中加入700 μl漂洗液PW(请先检查是否已加入无水乙醇),13,000 rpm (~17,900×g) 离心30-60秒,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。
2 @; S9 ?6 k( e5 E& g7. 向吸附柱CB3中加入500 μl漂洗液PW,13,000 rpm (~17,900×g) 离心30-60秒,弃掉收集管中的废液。。3 t9 `* J0 B f- ^" Q# ]& J" m( {
8. 将吸附柱CB3重新放回收集管中置于13,000 rpm (~17,900×g) 离心2分钟,目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。将吸附柱CB3置于室温或50℃温箱放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
4 ]. K, z7 e- G `* `2 ~漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。
D M: O" K+ R- i" J, `/ X9. 将吸附柱CB3置于一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加50-100 μl经65-70℃水浴预热的洗脱缓冲液EB, 室温放置2分钟, 13,000 rpm (~17,900×g) 离心1分钟将质粒溶液收集到离心管中。
+ D5 p2 q! V! y" u10. 为了增加质粒的回收效率,可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,重复步骤9。 ! ?. `6 ]$ c# d+ h" V% J4 t
11. 用琼脂糖凝胶电泳检测质粒提取的结果。/ b @' k8 W K! [3 F
对于大小超过10 kb的质粒在吸附和洗脱时可以适当的延长时间,以增加提取效率。( c u6 ]5 g0 P
洗脱缓冲液体积不应少于50 μl,体积过小影响回收效率。) I2 _: P; A- H5 }, k
洗脱液的pH对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内,pH值低于7.0会降低洗脱效率;且DNA产物应保存在-20℃,以防DNA降解。0 B) G' s0 s1 k% X- [* W( n: K1 Y! E
也可用TE buffer (10 mM Tris•Cl, 1 mM EDTA, pH 8.0)作为洗脱缓冲液,但EDTA可能会影响后续的测序反应等实验。
4 P8 | p% @0 ?8 N低拷贝或大质粒(>10kb)提取' E. ^& b# A6 O5 i* p
如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒,应加大菌体使用量,使用5-10 ml过夜培养物,同时按比例增加P1、P2、P3的用量,洗脱缓冲液应在 70℃预热,其它步骤相同。& U( j. B( R5 V* x6 D
质粒DNA浓度及纯度检测8 z4 K2 o: V' D: O3 a% p# e
得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。电泳可能为单一条带,也可能为2到3条DNA条带,这主要与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。OD260值为1相当于大约50 μg/ml 双链DNA。. B# M5 c0 M) u
OD260/OD280比值应为1.7-1.9,如果洗脱时不使用洗脱缓冲液,而使用去离子水,比值会偏低,但并不表示纯度低。因为pH值和离子存在会影响光吸收值。 |
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